Q1、做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
A1：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

Q2、同一公司的不同抗体用某个稀释度对一种抗体效果好，另外一种抗体可不可以用同种稀释度进行稀释？
A2：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要进行实验摸索。

Q3、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
A3：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

Q4、Western Blot 中抗体的重复应用问题
A4：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4℃保存，避免反复冻融。

Q5、做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？
A5：最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。